Cеменоводство подсолнечника
Система гибридного семеноводства включает выращивание в институтах-оригинаторах маточных суперэлитных и элитных семян самоопыленных линий, их стерильных аналогов, семян родительских линий-восстановителей фертильности пыльцы, а также семян первого поколения стерильных простых гибридов, являющихся родительскими формами трехлинейных и более сложных гибридов подсолнечника.
Выращивание на участках гибридизации семян гибридов первого поколения происходит на полях семхозов, фермерских хозяйств, имеющих соответствующую лицензию.
Как и для сортов, участки гибридизации следует размещать на полях, где подсолнечника не было 6–8 и более лет. От других посевов и падалицы подсолнечника пространственная изоляция должна быть не менее 1,5 км, а временная – 25 суток. При наличии лесополосы, водоема изоляция может быть меньше. Хорошие результаты можно получить при размещении участка по вспашке на глубину 25–27 см после зерновых колосовых, кукурузы на силос. Под вспашку или предпосевную культивацию следует внести минеральные удобрения N40Р60К45, а при посеве – N10Р20.
Весной кроме выравнивания поля боронами, целесообразно провести ранневесеннюю и предпосевную культивацию на глубину 8–10 и 5–7 см.
Для борьбы с сорняками под предпосевную культивацию эффективно применить гербициды (трефлан – 2,5–5,0 л/га, харнес – 2,5 л/га), а также при необходимости междурядные обработки с присыпанием сорняков окучниками в рядках.
Сеять семена родительских форм надо при прогревании почвы до 10–12°С на глубину 5–7 см, но во влажную почву. Послепосевное прикатывание эффективно только при расположении семян на влажной «подушке» почвы и при планировании послевсходовых боронований. Влажную почву прикатывать нельзя, так как ее уплотнение приведет к изреженности посева.
Густота стояния материнской формы к уборке должна для большинства линий равняться 50–55 тыс./га. С учетом браковки растений при сортополках и полевой всхожести нужно высевать 70 тыс. семянок на 1 га.
Схема размещения родительских форм каждого гибрида могут быть различны. Однако, при использовании восьмирядной сеялки СУПН–8, расположение материнских и отцовских рядков обычно практикуется по схеме 6:2, 12:4, 14:2, а для шестирядной – 8:4, 12:6, 18:6, 10:2. Если материнская и отцовская формы различаются по времени цветения, то сеют их на участках гибридизации в разные сроки, рекомендуемые учреждением-оригинатором.
При появлении на посевах медляков, долгоносиков, жуков кравчиков, тли для защиты всходов подсолнечника их необходимо обработать децисом (0,15 л/га), Би–58 (1 л/га) и др. С целью борьбы с гнилями растений целесообразно в период цветения опрыскать подсолнечник препаратом колфуго супер (2 л/га). В течение вегетации при проявлении болезней или в целях профилактики важно растения обработать препаратами амистар экстра (0,75 л/га), танос (0,5 кг/га), дерозал (1,5 л/га) и др.
Чтобы сохранить биологическую чистоту и выравненность гибрида, очень важно своевременно и качественно проводить сортовые прополки и фитосанитарные прочистки материнских и отцовских растений.
Для этого в рядках этих форм удаляют нетипичные по морфологическим признакам, больные растения. Первый раз сортополку делают в фазе 3–5 пар листьев. В последующем на протяжении периода цветения у материнской формы удаляют фертильные растения, ветвистые, больные, высокие, низкие. Фертильные корзинки кладут цветками вниз, а стебли срезают. Эту работу проводят с 6 до 10 часов и заканчивают с окончанием цветения. Рядки отцовской формы после отцветания удаляют или придавливают к земле дисками, что обеспечивает хорошее проветривание посева и упрощает уборку материнской формы.
К уборке материнских растений приступают при влажности семян 9–10 %. Если влажность семян высокая – 25–35 %, появились гнили – проводят десикацию реглоном (2–3 л/га) и через 6–8 дней приступают к уборке. Чтобы меньше обрушилось семян частоту вращения барабана комбайна снижают до 300 об/мин. Поступающие на ток семена немедленно очищают от вороха и при необходимости доводят до стандартной влажности 7–8 %, затем калибруют и затаривают в мешки.
Фертильный подсолнух что значит
СЕМЕНОВОДСТВО ГИБРИДОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА
В целях гарантии пространственной изоляции семенных посевов, где выращивают семена родительских форм и семена гибридов первого поколения, в нашей стране созданы специализированные зоны.
Семеноводство гибридного подсолнечника существенно отличается от семеноводства сортов-популяций. Оно ведется на основе цитоплазматической мужской стерильности. Можно выделить три этапа этого семеноводства.
На первом этапе научно-исследовательские учреждения выращивают маточные семена родительских форм стерильных аналогов — закрепителей стерильности и линий-восстановителей фертильности. На втором этапе научно-исследовательские учреждения и семеноводческие хозяйства специализированной зоны размножения родительских линий производят семена суперэлиты и элиты родительских форм. На третьем этапе специализированные семеноводческие хозяйства на участках гибридизации выращивают гибридные семена первого поколения для производственных посевов в колхозах и совхозах.
При выращивании семян родительских форм (участки размножения) и гибридов первого поколения (участки гибридизации) применяется та же технология, что и при производстве товарных семян с учетом специфических приемов гибридного семеноводства.
Участки размножения располагают не ближе 5, а участки гибридизации — 3 км от других посевов подсолнечника. Нарушение этих норм может полностью обесценить работу по семеноводству гибридного подсолнечника, так как гибридные семена не дадут ожидаемого повышения урожайности за счет гетерозисного эффекта.
На участках размножения стерильный и фертильный аналоги высевают одновременно, в один срок. Если материнская и отцовская формы различаются по времени цветения, то на участках гибридизации их сеют в разные сроки, рекомендуемые научно-исследовательскими учреждениями. При посеве надо исключить всякую возможность смешивания семян родительских форм гибридов. На участках гибридизации и размножения стерильных форм нельзя делать поперечных обсевов краев поля, потому что это неизбежно приведет к смешиванию семян материнских и отцовских растений. Если на участках гибридизации и
размножения стерильных аналогов посевы получились изреженными, проводить подсев на них не допускается.
Растения стерильных и фертильных линий трудно различить по морфологическим признакам. Внешнее их отличие лишь в том, что в период цветения фертильные формы репродуцируют пыльцу, чего не наблюдается у стерильных форм. Поэтому сеять эти формы надо так, чтобы их можно было легко распознавать по определенно чередующимся рядкам с пропусками между формами.
На участках размножения принято несколько схем чередования стерильной линии (материнская форма) и линии-закрепителя (отцовская форма). Лучшую схему для конкретных линий указывает научное учреждение-оригинатор. Наиболее часто чередуют восемь или десять рядков материнской формы с двумя или четырьмя рядками отцовской: 8 : 1 : 2 : 1, 8 : 1 : 4 : 1, 10 : 1 : 4 : 1, где единица — это пустой рядок, 8 и 10 — материнская, 2 и 4 — отцовская формы.
Посев проводят сеялками СУПН-8 или СПЧ-6. Принятой схемы посева достигают соответствующим подбором банок, куда засыпают семена материнской и отцовской линий, оставляя пустые для разграничительных пропусков. Например, для схемы 10 : 1 : 4 : 1 при посеве сеялкой СУПН-8 две банки слева засыпают семенами отцовской формы, третью — оставляют пустой, пять банок подряд (четвертую, пятую, шестую, седьмую и восьмую) заполняют семенами материнской линии: ООПМММММ. Такую же схему можно получить при посеве двумя сеялками: все восемь банок сеялки СУПН-8 заполняют семенами материнской формы, а у сеялки СПЧ-6 крайние слева и справа две банки оставляют пустыми, а в средние четыре — засыпают семена отцовской формы: первым движется агрегат с сеялкой СПЧ-6, за ним — с СУПН-8: ПООООП — ММ ММ ММ ММ — ПООООП. Схема 8 : 1 : 2 : 1 легко получается при работе одной сеялки СПЧ-6: в первую левую банку помещают семена отцовской формы, вторую оставляют пустой, следующие
четыре банки заполняют семенами материнской формы: ОПММММ.
На участках гибридизации, где выращивают семена гибридов первого поколения, соотношение родительских компонентов определяется прежде всего в зависимости от пыльцеобразующей способности отцовской формы.
На этих участках материнские и отцовские линии высевают с разграничительными пропусками или без них. Например, линии гибрида Почин высевают по схеме 10 : 1 : 4 : 1, используя сеялку СУПН-8 в таком варианте: ООПМММММ. Поскольку у этого гибрида отцовская форма зацветает позже материнской на 3—5 дней, то сеют формы на разную глубину, для чего левые два сошника сеялки устанавливают на глубину посева семян (отцовской формы) 5—6 см, а остальные — 7— 8 см. Этим достигается совпадение в сроках цветения родительских форм (Воскобойник и др., 1987).
Если отцовская форма ветвистая, то сев на участке гибридизации можно проводить без разграничительных пропусков, чередуя материнские и отцовские формы: 8 : 4 или 12 : 4. При отношении 8 : 4 у сеялки СПЧ-6 две левые банки заполняют семенами отцовской, остальные четыре — материнской формы: ООММММ. Для отношения 12 : 4 используют сеялку СУПН-8, у которой в две левые банки засыпают семена отцовской формы, а в остальные шесть — материнской: ООММММММ.
Рядки, засеянные отцовской формой на участках размножения и участках гибридизации, после того как они полностью отцветут, обязательно выкашивают, используя зеленую массу на кормовые цели. Этим исключается возможность смешивания семян родительских форм, улучшается последующая уборка материнских растений. Кроме того, прокосы способствуют лучшему проветриванию посева материнских форм, что уменьшает поражение их болезнями.
Для сохранения биологической чистоты размножаемых линий особенно тщательно надо удалять в рядках отцовской формы нетипичные (примесные), материнской формы — фертильные растения.
На участках размножения до начала цветения проводят не менее трех сортовых прополок и фитосанитарных прочисток (при 2—3 парах настоящих листьев, 10—12 листьях, перед цветением), а на участках гибридизации — не менее двух. При этом тщательно удаляют нетипичные и больные растения. Нельзя допускать до цветения ни одного растения подсолнечника, которое отличалось бы по какому-либо признаку от растений основного типа.
В период цветения на участках размножения и гибридизации сортовые прополки и прочистки совмещают с контролем за полнотой стерильности материнских растений. Этот контроль проводят в ранние утренние часы в самом начале цветения, когда зацветает не более 1—2 кругов цветков в корзинке, и продолжают до конца цветения. При
этом на участках размножения удаляют выщепляющиеся или случайно попавшие фертильные растения в рядках стерильных аналогов, а на участках гибридизации — в рядках материнских форм.
Типичность и стерильность выращенных семян проверяют в зимний период методом грунтового контроля.
Уборка урожая семян гибридов существенно не отличается от уборки сортов-популяций. На участках суперэлиты ее проводят в две фазы: корзинки срезают вручную и накалывают на стебли, а затем обмолачивают комбайном. На участках размножения элиты и участках гибридизации применяют десикацию посевов, а затем проводят прямое комбайнирование. После обмолота семена очищают, затаривают в мешки и хранят в складах штабелями высотой не более шести мешков.
kak_eto_sdelano
kak_eto_sdelano Как это сделано, как это работает, как это устроено
Самое познавательное сообщество Живого Журнала
Посев начинается с подбора участка, основным требованием является отсутствие других посевов подсолнечника в радиусе трех километров. Пожалуй это самая сложная часть в семеноводстве подсолнечника.
Далее идет посев. Перед посевом семена обрабатываются комплексом препаратов, которые обеспечивают их защиту от болезней и вредителей с момента прорастания и на протяжении 2-3 недель с момента всходов, когда семена наиболее уязвимы. Поэтому семена в сеялке имеют несколько непривычный цвет.
Обычно подсолнечник сеют с междурядьем 70 см, но ниже представлена сеялка и для посева на 45 см
Используются и более широкие агрегаты, тогда схема посева меняется.
Сеялку при этом приходится иногда частично разбирать.
За полем требуется тщательный уход. Начиная от контроля состояния всходов
не пора ли сделать междурядную обработку
или опрыскать от сорняка
список можно продолжать бесконечно.
Незадолго до начала цветения начинается работа, направленная на получение качественных семян. Агроном собирает бригаду и начинает видовые прополки. Люди становятся рядами через 3-4 ряда и несколько раз проходят поле, удаляя нетипичные растения.
работа эта повторяется 2-3 раза до начала цветения, с интервалом в 5-7 дней. На этом этапе часто «попадаются» любители прятать в подсолнечнике делянки иных растений вида Cannabis indica L. Ну не ожидают подобные любители (или профессионалы) что по данному полю народ будет бродить косяками как форель на нерест. Местный участковый ставит себе в отчет уничтожение делянки наркотических растений.
Тут агроному приходится спать еще меньше. Каждый день, с самого утра ему с бригадой надо пройти ту часть поля, которая засеяна материнской формой и удалить все растения, имеющие пыльцу. Как их отличить?
Вот стерильная корзинка материнской формы, без пыльников:
вот более крупным планом:
И вот они в массиве
Итак, мы остановились на том, что подсолнечник зацвел:
Получили вот такое полосатое поле:
Вот, например, с высоты птичьего полета (цветение уже завершилось)
Есть и небольшое видео
Сон у агронома сокращается до минимума. Каждый день, с самого раннего утра, он с бригадой приезжает на поле и удаляет все фертильные растения материнской формы (отцовская должны быть вычищена еще до момента цветения).
Фертильное растение матери сламывается под корень и укладывается цветком вниз
Запаса влаги в стебле хватит на цветение еще в течении одного двух дней, поэтому важно сделать цветок недоступным для пчел.
А вот в семена отцовская форма не должна попасть не в коем случае.
Поэтому самая стойкая часть бригады, дожившая до конца сезона проходит по полученным прокосам и удаляет растения отца, которые трактор случайно «завалил» в материнскую форму.
В таком виде поле постепенно созревает и наливается. Удаленные ряды улучшают циркуляцию воздуха и снижают риск возникновения болезней. Да и опрыскиватель получает возможность при необходимости проехать по полю и провести обработку фунгицидами.
Сейчас это не столь актуально с появлением самоходных высококлиренсных опрыскивателей, но еще лет десять назад было большой проблемой.
Итак, поле постепенно дозревает:
К моменту уборки поле выглядит вот так:
Корзинка налилась и выспела:
И наконец, комбайн заходит на поле:
Для снижения травмирования семян используется комбайн с роторной системой обмолота.
Убранное семенное сырье отправляется на завод, где ему и суждено превратиться в семена.
Жми на кнопку, чтобы подписаться на «Как это сделано»!
Если у вас есть производство или сервис, о котором вы хотите рассказать нашим читателям, пишите Аслану (shauey@yandex.ru) и мы сделаем самый лучший репортаж, который увидят не только читатели сообщества, но и сайта Как это сделано
Подписывайтесь также на наши группы в фейсбуке, вконтакте, одноклассниках, в ютюбе и инстаграме, где будут выкладываться самое интересное из сообщества, плюс видео о том, как это сделано, устроено и работает.
Способ идентификации стерильности/фертильности подсолнечника
Владельцы патента RU 2524135:
Область техники, к которой относится изобретение
Более конкретно, настоящее изобретение относится к методам определения специфических ДНК-маркеров в ядерном и митохондриальном геномах культурного подсолнечника с целью интенсификации промышленного семеноводства, определения чистоты селекционного материала и облегчения поиска носителей генов цитоплазматической мужской стерильности orfH522 и носителей ядерного гена восстановления фертильности пыльцы Rf1. Изобретение относится к способу идентификации цитоплазматической мужской стерильности типа РЕТ1 и гена восстановителя фертильности пыльцы ЦМС РЕТ1 у подсолнечника с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции.
Гибриды имеют ряд преимуществ по сравнению с сортами-популяциями. Гетерозисный эффект гибрида при соблюдении всех правил агротехники дает существенную прибавку урожая семян. Гибриды первого поколения всегда выровнены по всем признакам, в том числе по длине вегетационного периода и высоте. Это уменьшает вероятность заражения болезнями в период цветения и сокращает потери урожая при уборке. Гибриды, как правило, автофертильны, что важно для завязывания семян в период опыления и формирования полноценного урожая в условиях дефицита насекомых-опылителей. Использование гибридов позволяет гарантировать защиту прав селекционера и экономически выгодно селекционным фирмам, так как вынуждает производителей товарного подсолнечника закупать семена ежегодно /3/.
Как известно, для характеристики организмов, в том числе и растений, широко используют морфологические, биохимические (белковые) и молекулярные (на уровне ДНК) маркеры. Однако морфологические признаки имеют определенные ограничения, связанные с субъективностью анализа, некоторые диагностические признаки проявляются только на конкретной стадии развития. Кроме того, морфологические маркеры недостаточно полиморфны и в большинстве случаев некодоминантны. Их проявление часто зависит от воздействий окружающей среды /4, 5/. Основным ограничением для применения биохимических маркеров является малое число локусов в геноме, которое может быть ими маркировано или определено. Полиморфизм разного рода белков зависит от органа или тканей растений, из которых их выделяли /4/.
Использование молекулярных маркеров открыло большие перспективы для детального картирования хромосом, идентификации генов, их клонирования, а также создания новых сортов и гибридов сельскохозяйственных растений, в том числе и подсолнечника /7/.
В настоящее время для прогнозирования уровня проявления гетерозиса помимо общей генетической дивергентности между родительскими формами необходимо учитывать также и маркеры для конкретных количественных признаков. Маркерный анализ локусов количественных признаков позволяет определять их эффекты на уровень комбинационной способности родительских форм. В специальном номере журнала «Theoretical and Applied Genetics», посвященном конференции «Heterosis in Plants», сообщается о маркировании у кукурузы (Z.maize) 13 локусов гетерозиса /8/.
Что касается подсолнечника, то в настоящий момент для предсказания эффекта гетерозиса у данной культуры на основании оценки степени генетических различий между родительскими формами гибридов использовали AFLP (amplified fragment length polymorphism) и SSR (simple sequence repeats) маркеры /9, 10/. Однако было показано, что уровень генетических различий между материнскими и отцовскими формами гибридов подсолнечника, определенный с помощью данных маркеров, в общем, слабо коррелирует с их специфической комбинационной способностью и степенью проявления гетерозиса у гибридов первого поколения.
Следует специально оговорить, что работы в области маркер-опосредованной селекции возможны только в тесной кооперации генетиков и селекционеров, поскольку состоят, как минимум, из двух этапов /6/:
1. Подготовительный этап, в процессе которого генетики накапливают знания относительно генетического контроля интересующего селекционера признака, а также подбирают подходящие генетические маркеры.
2. Этап селекционной работы, которую селекционер ведет привычными для него методами, но с использованием предложенных генетиками молекулярно-генетических маркеров.
Примерный перечень работ, выполняемых на каждом этапе, можно представить следующим образом.
Предварительные работы (генетики)
— Построение геномных молекулярно-генетических карт.
— Поиск функционально значимых генов (candidate gene):
а) поиск генов количественных признаков;
б) поиск адаптивно-значимых генов;
в) определение положения целевого гена на хромосомной карте;
подбор полиморфных ДНК-маркеров.
— Анализ генетического разнообразия селекционного материала, поиск уникальных аллелей.
Селекционные работы (селекционеры)
— Тестирование генов в исходном материале (подбор доноров).
— Бекроссирование с отбором по маркерам.
— Объединение аллелей в потомстве:
а) целенаправленное введение аллелей в потомство («gene pyramiding»).
б) отбор гомозигот по доминантным генам в гибридах.
Успешное использование MAS в сельском хозяйстве должно обеспечить более высокую эффективность, меньшую стоимость и меньшую продолжительность беккроссирования по сравнению с традиционными методами селекции /11/.
Так, например, из RU 2008103451, 10.08.2009 известен способ получения генетически чистых семян материнской формы для гибрида подсолнечника, основанный на принципе временной изоляции посевов в фазу их цветения от переопыления с другими формами подсолнечника, включающий посев семян в ранний по отношению к оптимальному для данного региона срок. На первом этапе растения выращивают в закрытом грунте, а затем в открытом грунте. Осуществляют посев семян стерильного аналога и закрепителя стерильности материнской формы гибрида в наполненные почвой рассадные горшочки, выращивают рассаду в отапливаемой теплице до фазы второй пары настоящих листьев. Затем рассаду высаживают в открытый грунт по схеме 6:2, где 6 рядов стерильного аналога чередуются с 2 рядами закрепителя стерильности.
Необходимо подчеркнуть, что корректная идентификация мужской фертильной нормальной (N-) цитоплазмы и мужской стерильной (S-) цитоплазмы у продовольственных культур чрезвычайно важна в промышленном семеноводстве. Оценка чистоты гибридных семян и цитоплазматических геномов основана на оценке морфологических характеристик (которые отличают гибриды) в репрезентативной выборке растений только на стадии цветения. В таких случаях семена должны храниться в течение года, т.е. до последующего вегетационного периода, прежде чем они смогут поступить в продажу. Таким образом, для семенных компаний большие объемы капитала, заперты в форме гибридного запаса семян в течение длительного времени в ожидании результатов полевых тестов. К тому же, еще один существенный недостаток данного подхода в том, что его результаты субъективны из-за влияния окружающей среды на выражение морфологических характеристик. Кроме того, не исключено, что неблагоприятные климатические условия (например, засуха) может повредить или уничтожить урожай, что не позволит сделать правильную оценку результатов такой трудоемкой работы.
Известен способ (RU 2004126246, 20.04.2005) определения генетической идентичности, генетического разнообразия, геномных вариаций или полиморфизмов, аллельных вариаций и кодоминантной оценки в пределах определенного популяционного пула. Создан аналитический набор для демонстрации генетической идентичности, генетического разнообразия, геномных вариаций или полиморфизмов, аллельных вариаций и кодоминантной оценки в популяционном пуле, характеризующийся тем, что он содержит одноцепочечные олигонуклеотидные последовательности, причем каждая олигонуклеотидная последовательность комплементарна специфическому сайту, где последовательность ДНК, представляющая занятый сайт интеграции, содержит два отдельных участка последовательности одинаковой или разной длины, причем один из отдельных участков последовательности представляет собой фланкирующую область мобильного элемента (ME), а другой отдельный участок последовательности представляет собой конец указанного мобильного элемента, а олигонуклеотидная последовательность, представляющая соответствующий свободный сайт интеграции, содержит две фланкирующие области, окружающие мобильный элемент. Данный способ подходит для гарантированной и ускоренной селекции, а также для генотипирования, идентификации, филогенетических исследований, определения родительского статуса, методов судебной экспертизы, диагностики заболеваний у людей, гаплотипирования и анализа родословной и в селекции растений и животных путем демонстрации генетической идентичности, генетического разнообразия, геномной вариации или полиморфизма и, в частности, кодоминантной оценки.
Способ согласно RU 2004126246, 20.04.2005 не эффективен для дискриминации линий носителей цитоплазматической мужской стерильности и линий восстановителей фертильности пыльцы вообще и подсолнечника в частности.
Для растений сои и кукурузы описан (RU 99122162, 10.08.2001) способ идентификации одного или более локусов с помощью генетических маркеров, ассоциированных с фенотипическими признаками культурных растений. Для этого необходимо провести генотипирование большого количества исследуемых форм и определить информативные генетические маркеры, при этом индивидуальные образцы не должны являться членами расщепляющейся популяции. Далее проводится сравнение данных молекулярно-генетического анализа с фенотипическими данными, полученными для одних и тех же образцов. На следующем этапе работ определяют наличие связи между локусами генетических маркеров и анализируемыми признаками. Информативные генетические маркеры выбирают из группы, состоящей из RFLP, SSR, RAPD, AFLP и аллоферментов.
Однако область применения данного способа распространяется на культурные растения, выращиваемые в конкретных условиях окружающей среды, причем подходит исключительно для кукурузы и сои. Признак при этом выбирают из группы, состоящей из урожайности, полегаемости, высоты растений, продолжительности вегетационного периода, устойчивости к болезням, устойчивости к вредителям, реакции на недостаток питательных веществ и состав зерна. Наличие настоящих признаков невозможно непосредственно связать с цитоплазматической мужской стерильностью.
Чем более сцеплены данные маркеры с геном Rf1, тем, соответственно, выше их надежность в идентификации генотипов-восстановителей фертильности пыльцы ЦМС на основе Н. petiolaris.
В настоящее время молекулярно-биологические исследования генома подсолнечника недостаточно развиты и маркеры, необходимые для идентификации гена Rf1, мало изучены. Настоящий факт весьма затрудняет поиск этого гена у линий и сортов подсолнечника.
В ЕР 1382612, 21.01.2004 решена проблема точной идентификации восстановителей фертильности пыльцы Kosena radish, Ogura radish, Yuanhong radish. Авторы вышеуказанного изобретения успешно клонировали ген Rf1 для рапса и редьки. Таким образом, в вышеупомянутом изобретении описан белок, участвующий в восстановлении мужской стерильной цитоплазмы. Данный белок имеет 14 или более PPR-мотивов, в которых группа тандемов делится на 3 или более блоков, каждый из которых состоит, по крайней мере, из двух или более мотивов PPR, блоки в карбоксильном терминале имеют 4 PPR мотива. Однако ген Rf1, описанный в настоящей работе, имеет совершенно иную природу, чем ген Rf1, ответственный за восстановление фертильности пыльцы у подсолнечника. Данный ген восстанавливает фертильность только в том случае, если развитие цитоплазматической мужской стерильности связано с наличием в митохондриальном геноме гена orf125 или orf138. К тому же, речь идет об обнаружении белкового продукта, а не о наличии специфической молекулярно-генетической последовательности. Растения подсолнечника с цитоплазматической мужской стерильностью с помощью данного способа идентифицировать нельзя.
Для риса описано несколько изобретений, направленных на идентификацию носителей Rf генов, основанных на использовании маркеров, созданных на основе либо последовательности самого искомого гена, либо сцепленной с ним маркерной последовательности.
В ЕР 1541687, 15.01.2005 описан способ идентификации носителей генов восстановителей фертильности пыльцы у риса с ЦМС ВТ-типа.
Ген, являющийся объектом вышеуказанного изобретения, кодирует белок, аминокислотная последовательность которого демонстрирует 70% сходство с аминокислотной последовательностью продукта гена, описанного ранее в Japanese Patent Public Disclosure /31/, где на основе последовательности RFLP-маркеров были разработаны кодоминантные ПЦР-маркеры, локализованные на 10 хромосоме риса вблизи Rf-1 гена. Тем не менее, большинство из этих ПЦР-маркеров находились на генетическом расстоянии более чем 1 сМ от Rf-1 гена.
Были разработаны ПНР маркеры проксимальнее Rf-1 локуса и предложен способ обнаружения Rf-1 гена с использованием этих маркеров. Были разработаны пары праймеров, специфичные для конкретных областей локуса Rf-1, с использованием ПЦР, специфичных рестриктаз и электрофоретического метода детекции продуктов амплификации, способные давать полосы разного размера у риса линии Japonica.
Когда стало ясно, что локус Rf-1 гена расположен между ДНК-маркерами S12564, Tsp509I и С1361, MwoI на хромосоме 10 риса, стало возможным создание и использование ПЦР-маркеров локализованных в непосредственной близости от Rf-1 гена. Например, в соответствии с изобретением, образцы риса, согласно тесту проверяются на присутствие в геноме, по крайней мере, одного из ДНК маркеров, перечисленных в изобретении, тем самым определяя, является ли образец носителем гена Rf.
Основной целью изобретения согласно ЕР 2258165, 08.12.2010 являлась разработка методики для выявления генотипа по локусу Rf17 на основе его специфической последовательности оснований, а также обеспечение техники искусственного создания линий восстановителей фертильности. Авторы данного изобретения также обнаружили, что CW-тип ЦМС восстанавливается путем снижения экспрессии orf11.
Существенным ограничением данного способа так же, как и в случае ЕР 1541687, является применение данных ДНК-маркеров только для идентификации носителей гена восстановителя фертильности пыльцы у риса с ЦМС CW-типа. К тому же, развитие данного типа ЦМС связано с наличием в митохондриальном геноме гена orf11, а восстановление такого типа ЦМС происходит в присутствии гена Rf-17 риса, который отличен от генов Rf других культур, в том числе и подсолнечника.
Учитывая актуальность проблемы разработки эффективных подходов быстрого создания высокоурожайных гетерозисных гибридов подсолнечника на основе цитоплазматической мужской стерильности ЦМС РЕТ1 и поиска генов восстановления фертильности пыльцы (Rf) авторами настоящего изобретения была проведена идентификация маркера ядерного гена восстановителя фертильности пыльцы Rf1 ЦМС типа РЕТ1 у селекционных линий подсолнечника. Также проведена амплификация маркера митохондриального гена orfH522 у линий с ЦМС РЕТ1 и RIG0. На основе последовательности митохондриального гена orfH522 и ядерного маркера гена Rf1 были синтезированы специфические праймеры для одновременной идентификации этих генов в генотипе подсолнечника с помощью мультиплексной ПЦР.
Несомненным преимуществом данной тест-системы является тот факт, что идентификация данных продуктов амплификации возможна в пределах одной реакции. Альтернативно, праймеры, используемые для ПЦР-амплификации, могут быть помечены флоуресцентными хромофорами, что позволяет идентифицировать продукты реакции на спектрофлюориметре.
Следует подчеркнуть, что при проведении мультиплексной ПЦР необходимо устанавливать компромиссные условия для осуществления энзиматической амплификации (температура ренатурации, концентрация Mg+, концентрация праймера), при которых все пары праймеров инициируют синтез ПЦР-продуктов ожидаемого размера. Кроме того, на это явление накладывает отпечаток другое обстоятельство, которое состоит в сильном различии в эффективности амплификации различных фрагментов. Следовательно, специалист часто сталкивается с такой проблемой, что продукты некоторых пар праймеров не обнаруживаются при проведении мультиплексных ПНР-реакций.
К настоящему времени этот тип ЦМС (РЕТ1) довольно хорошо изучен. В частности, известны его молекулярно-генетические основы. Показано, что у подсолнечника ЦМС типа РЕТ1 является результатом реорганизации митохондриального генома растений. В настоящее время уже определена инверсия размером 11 т.п.н. и инсерция 5 т.п.н., несущая ген orfH522 с 3′-конца гена atpA, кодирующего альфа субъединицу митохондриальной F1-АТФ синтазы (Фиг.3). При этом образуется новая открытая рамка считывания. Ген orfH522 состоит из 57 п.н. гена orB (orfH873) и другой неизвестной части. Область реорганизации ограничена инвертированными повторами размером 261 п.н. /15, 37, 38, 39/. Интересно, что ген orfH522 и вся 5 т.п.н. инсерция состоят из фрагментов не только митохондриальных, но и ядерных ДНК, а также фрагментов неизвестного происхождения /40, 41/.
Новая orf котранскрибируется с геном atpA как полицистронная мРНК. Вследствие перестроек, описанных выше, синтезируется новый котранскрипт atpA-orfH522 и белок с молекулярной массой 16 кДа, который, как предполагают, встраиваясь в мембраны митохондрий, блокирует цепь транспорта электронов, тем самым нарушая энергетический баланс в спорогенных клетках /15, 39, 42, 43/.
Ядерные гены Rf, контролируют реакцию полиаденилирования atpA-orfH522 транскрипта, что индуцирует его разрушение РНКазой II и в конечном итоге приводит к восстановлению фертильности пыльцы /44/.
Краткое описание чертежей
Фиг.5 представляет собой графическое изображение электрофоретических спектров продуктов амплификации геномной ДНК ЦМС линий и их фертильных аналогов с праймерами (1orf f и 1orf r), идентифицирующими митохондриальный ген orfH522. Где:
Фиг.6 представляет собой графическое изображение электрофоретических спектров продуктов мультиплексной амплификации (праймеры: 1Rf f, 1Rf r и 1orf f, 1orf r) геномной ДНК линий ЦМС РЕТ1, ЦМС RIG0 и восстановителей фертильности пыльцы подсолнечника. Где:
Амплификацию ДНК-маркеров ядерного гена Rf1 и митохондриального гена orfH522, подсолнечника проводили, используя специфические олигонуклеотиды (ПЦР-праймеры).
| Таблица 1. | ||
| Список олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров для мультиплексной ПЦР | ||
| Название олигонуклеотида | Последовательность оснований | Количество |
| 1Rf f | ggcatgatcaagtacataagcacagtc | 10 пмоль |
| 1Rf r | tatgtacgggaatgagctccggtt | 10 пмоль |
| 1orf f | agtagcccgttccgtgtttatgga | 10 пмоль |
| 1orf r | ctttctatttgggtcatcgccgga | 10 пмоль |
| Примечание. В обозначениях праймеров индекс ′f′ означает «прямой», ′r′ означает «обратный». Последовательность оснований указана в направлении 5′-3′. |
Для ПНР-реакции использовали 25 мкл реакционной смеси, содержащей 4 мкл ДНК, 1.2 мкл 1.2 мМ dNTP, 2, по 0.5 мкл прямого и обратного праймера в концентрации 10 пМ, 10 мкл Taq полимеразы (Синтол, Москва) и 8.8 мкл H2O. При амплификации с последующим прямым секвенированием для ПЦР-реакции использовали 25 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл ДНК, 2.5 мкл 1.2 MMdNTP, 2.5 мкл 10х реакционного буфера Б (Silex, Москва), 2.5 мкл 2.5 мМ MgCl2, по 0.5 мкл прямого и обратного праймера в концентрации 10 пМ, 0.2 MioiTaq полимеразы (Синтол, Москва) и 11.3 мкл дионизованной H2O. Реакцию амплификации проводили в термоциклере PalmCycler (Corbett Research, Австралия) по следующей программе: 1) один цикл: 5 мин 95°С; 35 циклов: 15 сек 95°С, 30 сек 58°С, 25 сек 72°С один цикл: 1 мин 72°С. Продукты реакции амплификации разделяли электрофоретически в 2% агарозном или полиакриламидном геле с бромистым этидием (1 мкг/мл) и визуализировали с помощью гельдокументирующей системы Gel Doc 2000 (Bio-Rad, USA).
Альтернативно, праймеры, используемые для ПЦР, могут быть помечены флоуресцентными хромофорами, что позволяет идентифицировать продукты реакции на спектрофлуориметре.
Очистку фрагментов амплифицированной ДНК для последующего прямого секвенирования выполняли согласно описанной методике /49/. Амплификацию для секвенирования проводили в термоциклере GeneAmp PCR System 9700 (РЕ Applied Biosystems, USA) по следующей программе: один цикл: 1 мин 95°С; 30 циклов: 10 сек 96°С, 5 сек 50°С, 4 мин 60°С, один цикл ∞ 10°С. Секвенирование проводили на генетическом анализаторе 3100×1 Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA) с использованием набора реагентов BigDyeTerminator v.3.1 Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) с использованием флуоресцентно-меченых дидезоксинуклеотидов с одним из праймеров. Последующую очистку продуктов амплификации проводили на колонках Centri-Sep (РЕ Applied Biosystems, USA). Завершающий этап анализа нуклеотидных последовательностей выполняли с помощью компьютерной программы BioEdit, ver.7,09. В качестве контроля ПЦР использовали пробу, содержащую смесь реагентов без ДНК (отрицательный контроль). В образце с отрицательным контролем флуоресцирующих зон на электрофореграмме выявлено не было.
Олигонуклеотиды, сконструированные на основе последовательности гена orfH522 и секвенированной маркерной последовательности SCAR-маркера ОР-K13_454, синтезировали на ДНК-синтезаторе ASM-800 (Биоссет, г. Новосибирск, Россия) в направлении от 3′- к 5′-концу методом твердофазного синтеза в соответствии со стандартными протоколами фирмы-производителя. Автоматический ДНК-синтезатор ASM-800 эксплуатировался при следующих условиях:
— Температура окружающего воздуха 17-30°С.
— Относительная влажность 10-90%.
В качестве рабочего газа использовался газообразный гелий с содержанием:
— объемной доли гелия не менее 99,99%;
— объемной доли кислорода не более 0,003%;
— объемной доли водяных паров не более 0,003%.
Синтез олигонуклеотидов осуществляли амидофосфитным методом с использованием стандартных коммерческих реагентов в условиях модифицированных нами программ реакционных циклов. Для реакционных циклов с введением 3′-тиофосфорильных звеньев вместо стандартного окислителя, содержащего йод и воду, применяли свежеприготовленный 0,05 М раствор 3Н-1,2-бензодитиол-3-он-1,1-диоксида (GlenResearch, США) в ацетонитриле. Деблокирование и расщепление связи олигомера с носителем осуществляли с использованием стандартных процедур. Полученные препараты олигомеров анализировали методами ВЭЖХ, MALDI-TOFMS (Matrix Assisted Laser Desorption / lonization Time-of-Flight Mass Spectrometry), УФ-спектрофотометрией и электрофорезом в ПААГ.
В случае определения маркера, который, как предполагалось, способен идентифицировать носителей гена восстановителя фертильности пыльцы Rf на электрофореграмме четко визуализируется фрагмент, соответствующий размеру искомого локуса у ЦМС-линий, данный фрагмент не амплифицировался (Фиг.4).
У всех исследованных линий был выявлен амплифицируемый фрагмент размером около 183 п.н., включая ДНК линий с ЦМС RIG0, этот фрагмент использовался нами в качестве внутреннего контроля реакции амплификации геномной ДНК подсолнечника (контроль ложно-отрицательных реакций). У всех линий-восстановителей фертильности пыльцы ЦМС РЕТ1 инициирован синтез специфичного маркерного фрагмента гена Rf1 размером около 198 п.н.
12. RU 2008103451, 10.08.2009.
13. US 2006168694, 27.07.2006.
14. US 6803497, 12.10.2004.
16. RU 2004126246, 20.04.2005.
17. RU 99122162, 10.08.2001.
21. Bentolila S., Alfonso A.A., Hanson M.R. (2002). A pentatricopeptide repeat-containing gene restores fertility to cytoplasmic malesterile plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 10887-10892.
22. Kazama, Т., Toriyama, K. (2003). A pentatricopeptide repeat-containing gene that promotes the processing of aberrant apt6 RNA of cytoplasmic male-sterile rice. FEBS Lett. 544, 99-102.
23. Imai R, Koizuka N, Fujimoto H, Hayakawa T, Sakai T, Imamura J (2003) Delimitation of the fertility restorer locus Rfkl to a 43-kb contig in Kosena radish (Raphanus sativus L.). Mol. Genet. Genom. 269: 388-394.
24. Zhang Z., Zheng Y. Identification of Candidate Genes Associated with Fertility Restoration in Maize S Cytoplasmic Male Sterility. Plant Molecular Biology Reporter. 2008. Vol.26, N.1, 60-71.
25. Jo YD, Kim YM, Park MN, Yoo JH, Park MK, Kim BD, Kang ВС (2009) Development and evaluation of broadly applicable markers for Restorer-of-fertility in pepper. Mol Breeding published online: 30 July 2009. DOI 10.1007/s 11032-009-9318-3.
26. Wang F., Yue В., Hu J., Stewart J. McD., Zhang J. A Target Region Amplifi ed Polymorphism Marker for Fertility Restorer Gene Rf1 and Chromosomal Localization of Rf1 and Rf2 in Cotton. Crop Science, 2009. Vol.49, 1602-1608.
27. Small I., Peeters N. (2000). The PPR motif- a TPR-related motif prevalent in plant organellar proteins. Trends Biochem. Sci. 25, 46-47.
29. ЕР 1382612, 21.01.2004.
30. ЕР 1541687, 15.01.2005.
32. EP 2258165, 08.12.2010.
37. Siculella L, Palmer JD (1988) Physical and gene organization of mitochondrial DNA in fertile and male sterile sunflower. CMS associated alterations in structure and transcription of the atpA gene. Nucleic Acids Res 16: 3787-3799.
40. Zetsche K., Horn R. 1993 Molecular analysis of cytoplasmic male sterility in sunflower (Helianthus annuus). In: Plant mitohondria (Ed. by Kucku U., Brennike A.) Springer, Berlin, Heidelberg, New York. P.411-422.
46. Leclercq P. Identification of genes for restoring fertility to sterile cytoplasms in sunflower. Agronomic. 1984, 4:6, 573-576.
47. Попов В.Н., Кириченко В.В. Мужская стерильность подсолнечника. Теоретические и прикладные аспекты // Вicник Харкiвського Нацiонального аграрного унiверситету Серiя бiологiя, 2007, вип.2(11), с.18-33.
2. Способ по п.1, в котором продукты реакции амплификации разделяют электрофоретически в 2% агарозном или полиакриламидном геле с бромистым этидием.
3. Способ по п.1, в котором результаты ПЦР анализируют и регистрируют с помощью гельдокументирующей системы GelDoc 2000 (BioRad, USA).
5. Применение способа по п.1 в селекции растений.
6. Применение по п.5 для определения генетической чистоты ЦМС-линий.
7. Применение по п.5 для маркер-вспомогательной селекции подсолнечника системы ЦМС РЕТ1/Rf1.